Codex Vaticanus é um dos manuscritos mais antigos da Bíblia grega (Antigo e Novo Testamento). O Códex é nomeado após seu local de conservação na Biblioteca do Vaticano, onde tem sido mantido desde pelo menos o século XV. Está escrito em 759 folhas de vellum em letras unciais e foi datado do século IV. Acredita-se que o manuscrito tenha sido alojado em Cesareia no século VI, juntamente com o Codex Sinaiticus, pois eles têm as mesmas divisões únicas de capítulos nos Atos. Chegou à Itália – provavelmente de Constantinopla – após o Concílio de Florença (1438-1445). O manuscrito foi alojado na Biblioteca do Vaticano (fundada pelo Papa Nicolau V em 1448) por tanto tempo quanto se sabe, aparecendo no catálogo mais antigo da biblioteca de 1475 (com o número de prateleira 1209), e no catálogo de 1481. Em um catálogo de 1481 foi descrito como um "Biblia in tribus columnis ex membranis in rubeo" (Bíblia de três colunas de vellum).
O manuscrito foi organizado em um volume in-quarto, arranjado em resmas de cinco folhas ou de 10 folhas cada, semelhante ao Codex Marchalianus ou Codex Rossanensis; difere do Codex Sinaiticus por ter um arranjo de quatro ou três folhas. O número de resmas é freqüentemente encontrado na margem. Originalmente deve ter sido composto de 830 folhas de pergaminho, mas parece que 71 folhas foram perdidas. Atualmente, o Antigo Testamento consiste em 617 folhas e o Novo Testamento de 142 folhas. O pergaminho é extremamente fino. O tamanho das páginas é 27 cm por 27 cm.
O codex é escrito em três colunas por página, com 40–44 linhas por página, e 16–18 letras por linha. Nos livros poéticos do Velho Testamento (VT) apenas duas colunas preenchem uma página. No Pentateuco, Josué, Juízes, Rute, e I Reis 1:1–19:11 tem 44 linhas em uma coluna; em II Crônicas 10:16–26:13 são 40 linhas em uma coluna; e no Novo Testamento são 42 linhas. O manuscrito é um dos poucos manuscritos do Novo Testamento escrito com três colunas por página. Os outros dois codex gregos, escritos na mesma maneira são o Uncial 048 e Uncial 053. O Codex Vaticanus compreende um único volume in-quarto, contendo 759 finas e delicadas folhas de velino.
O Codex Vaticanus originalmente continha uma cópia quase completa da Septuaginta, faltando apenas 1-4 Livros dos Macabeus e a Prece de Manassés. As 20 folhas originais com o Gênesis 1:1–46:28a e o Salmo 105:27–137:6b foram perdidas e foram transcritas posteriormente por um escriba no século XV. Os versículos de II Reis 2:5–7, 10-13 também foram perdidos por causa de um rasgo em uma das páginas. A ordem dos livros do Antigo Testamento no codex é a seguinte: De Gênesis até II Crônicas está na ordem normal, após isso a ordem é a seguinte: 1 Esdras; 2 Esdras (Esdras-Neemias); os Salmos; Livro dos Provérbios; Eclesiastes; Cântico dos Cânticos; Jó; Sabedoria; Eclesiástico; Ester; Judite; Tobias; os profetas menores de Oséias até Malaquias; Isaías; Jeremias; Baruque; Lamentações e a Epístola de Jeremias; Ezequiel e Daniel. A ordem dos livros é diferente da do Codex Alexandrinus.
O Novo Testamento existente no Vaticanus contém os Evangelhos, os Atos dos Apóstolos, as Epístolas católicas, as Epístolas paulinas e a Epístola aos Hebreus (até Hebreus 9:14); faltando a Primeira Epístola a Timóteo, a Segunda Epístola a Timóteo, a Epístola a Tito, a Epístola a Filemon e o Livro do Apocalipse. Estes livros ausentes foram complementados no século XV (fólios 760–768) e catalogados separadamente como sendo o codex minúsculo 1957. Possivelmente alguns livros apócrifos do Novo Testamento foram incluídos no fim (tal como nos códices Sinaiticus e Alexandrinus) e também é possível que o Apocalipse também não tenha sido incluído.
O manuscrito tornou-se conhecido por estudiosos ocidentais por causa da correspondência entre Erasmo de Rotterdam e os prefeitos da Biblioteca do Vaticano. Partes do codex foram coligidas por vários estudiosos, mas numerosos erros foram feitos durante este processo. A relação do codex com a Vulgata não era clara e inicialmente os estudiosos não estavam cientes do valor do codex, o que mudou no século XIX, quando transcrições completas do codex foram concluídas. Foi nesse momento que os estudiosos perceberam que o texto diferia da Vulgata e do Textus Receptus.
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